磺胺喹惡啉檢測試劑盒使用說明書
（酶聯免疫法）
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法檢測組織、血清、蜂蜜、牛奶、尿液、飼料等樣本中的磺胺喹惡啉藥物（SQX），試劑盒由預包被偶聯抗原的酶標板、酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的磺胺喹惡啉藥物和酶標板上預包被偶聯抗原競爭抗磺胺喹惡啉藥物抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光度值與其所含磺胺喹惡啉藥物含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中磺胺喹惡啉藥物的殘留量。
2 技術指標
2.1 試劑盒靈敏度：0.5ppb(ng/ml)
2.2 反應模式：25℃，45min～15min
2.3 檢測下限：
組織（高檢測限方法）……………0.5ppb
組織（低檢測限方法）……………2.5ppb
血清、尿液…………………………2ppb
蜂蜜…………………………………0.5ppb
牛奶…………………………………10ppb
飼料…………………………………20ppb
2.4 交叉反應率：
磺胺喹噁啉（SQX）………………………100%
磺胺嘧啶（SD 或 SDZ）……………………＜1%
磺胺甲基嘧啶（SM1）……………………＜1%
磺胺二甲基嘧啶（SM2）……………………＜1%
磺胺間甲氧嘧啶（SMM）……………………＜1%
2.5 樣本回收率：
組織、蜂蜜………………………95±25%
尿樣、牛奶、血清、飼料……………85±25%
3 試劑盒組成
酶標板……………………………96 孔
標準液：各 1ml
0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb高標準液（紅蓋）：1ppm…………1ml
酶標記物（紅蓋）…………………5.5ml
抗體工作液（藍蓋）………………5.5ml
底物液 A（白蓋）……………………6ml
底物液 B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X 濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
2X 復溶液（黃蓋）…………………50ml
說明書………………………………1 份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）
4.2 微量移液器：單道 20μl-200μl，100μl-1000μl、多道 300μl
4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、乙腈、Na2HPO4·12H2O、NaOH 、
濃HCL 、NaH2PO4·2H2O
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結果。
5.2 配液：
配液 1：0.2M NaOH 溶液
0.8gNaOH 用去離子水 100ml 溶解
配液 2：0.02M PB 緩沖液
稱取 2.58g Na2HPO4·12H2O 和 0.44g NaH2PO4·2H2O 加去離
子水 500ml 溶解。
配液 3：0.5M 鹽酸溶液
4.3ml 濃 HCL 加入去離子水定容至 100ml 混勻。
配液 4：復溶液
將2×復溶液用去離子水 2 倍稀釋(1 份復溶液加 1 份去離子水)，用于樣本的復溶，復溶液在 4℃環境可保存一個月。配液 5:工作洗滌液
將濃縮洗滌液 20 倍稀釋(1 份洗滌液加 19 份去離子水)。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織樣本（高檢測限）處理方法
1）稱取 3±0.05g 均質組織樣本置離心管中，加入 3ml 0.02M PB 緩沖液充分振蕩混勻，再加入 4ml 乙酸乙酯和 2ml 乙腈，充分振蕩 10min，于 4000r/min 以上速度離心 10min；
2）移取 2ml 上層液體（約相當于 1g 的樣本）在 50-60℃氮氣或空氣吹干；
3）加 1ml 正己烷溶解干燥的殘留物，再加 1ml 復溶液，強烈振蕩 1min，4000r/min，離心 5min；
4）除去上層正己烷，取下層水相 50μl 用于分析。
樣本稀釋倍數：1 檢測下限：0.5ppb 5.3.2 組織樣本（低檢測限）處理方法
1）稱 2.0±0.05g 均質組織樣本于離心管中；加入 8ml 0.02M PB 緩沖液，震蕩 2min，4000r/min 以上離心 10min；
2）取 50μl 液體用于分析。
樣本稀釋倍數: 5 檢測下限：2.5ppb 5.3.3 血清樣本處理方法
1）將血樣本于室溫放置 30min，于 4000r/min 以上離心 10min，分離出血清或過濾血清；
2）取 1ml 血清，加入 3ml 0.02 M PB 緩沖液混合，混合 30s；
3）取 50μl 用于分析。
樣本稀釋倍數：4 檢測下限：2ppb 5.3.4 蜂蜜樣本處理方法
1）稱取 1±0.05g 蜂蜜樣本于 50ml 離心管中，加入 1ml 0.5M 鹽酸置于 37℃環境中 30min；
2）加入 2.5ml 0.2M 氫氧化鈉 (將 PH 值調至 5 左右)再加入 4ml 乙酸乙脂振蕩 5min，4000r/min 以上室溫離心 10min；
3）取 2ml 上層液體于 50-60℃下氮氣吹干，加 0.5ml 已稀釋好的復溶液復溶，混合 30s；
4）取 50μl 用于分析。
樣本稀釋倍數：1 檢測下限：0.5ppb 5.3.5 尿樣本處理方法
1）用 3ml 0.02 M PB 緩沖液與 1ml 經離心后的清亮尿樣本混合，混合 30s；
2）取 50μl 液體用于分析。
樣本稀釋倍數: 4 檢測下限：2ppb 5.3.6 牛奶樣本處理方法
1）將牛奶樣本用 0.02 M PB 緩沖液 20 倍稀釋（如 20μl 牛奶
+380μl 0.02 M PB 緩沖液），混合 30s；
2）取 50μl 用于分析。
樣本稀釋倍數：20 檢測下限：10ppb 5.3.7 飼料樣本處理方法
1）稱取 2.0±0.05g 飼料樣本至 50ml 聚苯乙烯離心管中，加入8ml 乙腈，振蕩 5min，室溫 4000r/min 以上離心 5min；
2）移取 1ml 上層有機相至 10ml 潔凈干燥玻璃試管中，在50-60℃氮氣或空氣吹干；
3）加入 1ml 正己烷，用渦旋儀渦動 30s，再加入 1ml 0.2M 磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動 30s 混勻，轉入 2ml 聚苯乙烯離心管中，室溫 4000r/min 以上離心 5min；
4）除去上層有機相，移取 100ul 下層水相至 2ml 離心管中，加入 900ul 0.2M 磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動 1min，混勻；5）取 50ul 用于分析。
樣本稀釋倍數：40 檢測下限：20ppb
6 酶聯免疫試驗步驟
將所需試劑從 4℃冷藏環境中取出，置于室溫平衡 30min 以上, 洗滌液冷藏時可能會有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于 2-8℃。
6.1 編 號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做 2 孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應：加標準品或樣本 50μl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物 50μl/孔，再加入 50μl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩 5 秒混勻，25℃反應 45 分鐘。
6.3 洗 滌：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用工作洗滌液 250μl/孔充分洗滌 5 次，每次間隔 30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯 色：每孔加入底物液 A 50μl，再加底物液 B 50μl，輕輕振蕩 5 秒混勻，25℃避光顯色 15 分鐘（若藍色過淺，可適當延長反應時間）。
6.5 終 止：每孔加入終止液 50μl，輕輕振蕩混勻，終止反應。
6.6 測吸光值：用酶標儀于 450nm 處測定每孔吸光度值（建議用雙波長 450/630nm）。測定應在終止反應后 10 分鐘內完成。
7 結果分析
7.1 百分吸光率的計算
標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以 100%，即
A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb 標準溶液的平均吸光度值
7.2 標準曲線的繪制與計算
以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準液的半對數曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線
上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實際濃度。若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）
8 注意事項
8.1 室溫低于 25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的 OD 值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在 ELISA 分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0 標準的吸光度值小于 0.5 個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。
8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，避免冷凍。
保 質 期：該產品有效期為 1 年，生產日期見包裝盒。
