甲硝唑檢測試劑盒使用說明書
（酶聯免疫法）
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法檢測組織、蜂蜜等樣本中的甲硝唑（Metronidazole，MNZ），試劑盒由預包被偶聯抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的甲硝唑和酶標板上預包被偶聯抗原競爭抗甲硝唑抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光度值與其所含甲硝唑含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中甲硝唑的殘留量。
2 技術指標
2.1 試劑盒靈敏度：0.5ppb(ng/ml)
2.2 反應模式：25℃ 30min～30min～15min
2.3 檢測下限：
組 織（雞、鴨肉/肝臟、魚、蝦、等）…………0.25ppb
蜂蜜 ………………………………………………0.25ppb
2.4 交叉反應率：
與類似物的交叉反應率：
甲硝唑(MNZ) ………………………………………100%
二甲硝咪唑 DMZ……………………………………68%
2.5 樣本回收率：
魚/蝦/禽/肝臟………………………………90±10%
蜂蜜樣本 ……………………………………90±10%
3 試劑盒組成
酶標板 1 塊，96 孔/板標準
液 6 瓶（黑蓋）：1ml/瓶
0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb 高標準液 100 ppb ………………………………1ml
抗體工作液 (藍蓋)………………………………5.5ml
酶標記物 (紅蓋)…………………………………11ml
底物液 A (白蓋)……………………………………6ml
底物液 B(黑蓋) ……………………………………6ml
終止液(黃蓋) ………………………………………6ml
20X 濃縮洗滌液(白蓋)……………………………40 ml
2X 濃縮復溶液(黃蓋)…………………………… 50 ml 說
明書………………………………………………1 份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、恒溫箱
4.2 微量移液器：單道 20μl-200μl、100μl-1000μl、多道 300μl
4.3 試劑：NaOH、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉、正己烷、乙酸乙酯 4 需要的器材和試劑 4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩 器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、恒溫箱 4.2 微量移液器：單道 20μl-200μl、100μl-1000μl、多道 300μl 4.3 試劑：NaOH、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉、正己烷、乙酸乙 酯
2）加入 9ml 乙酸乙酯，振蕩 5 分鐘，室溫 4000 轉/分，離心5 分鐘；
3）取上層有機相 6ml 至另一離心管中，加入 2ml 乙酸乙酯，2ml 2M 氫氧化鈉溶液，振蕩 5 分鐘，室溫 4000 轉/分，離心 5 分鐘；
4）取 4ml 清澈上層有機相至干凈玻璃試管中，30～40℃氮氣或空氣吹干；
5）加入正己烷 1ml，渦動 30s，再加入 0.5ml 復溶液混合 30秒，室溫 4000 轉/分以上，離心 5 分鐘；
6）去除上層有機相，取下層 50μl 液體用于分析。稀釋倍數 0.5 檢測下限 0.25ppb
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結果。
5.2 配液：
配液 1：0.1M 碳酸鹽緩沖液稱取 4.66g 無水碳酸鈉，0.5g 碳酸氫鈉去離子水 500ml 溶解，pH 10.6 。
配液 2：2M 氫氧化鈉溶液 稱取 40g 氫氧化鈉，加入去離子水 500ml 溶解。
配液 3：洗滌液將濃縮洗滌液 20 倍稀釋(1 份洗滌液加 19 份去離子水)。
配液 4：復溶液將2×復溶液用去離子水 2 倍稀釋（1 份復溶液加 1 份去離子水）,用于樣本的復溶，復溶液在 4℃環境可保存一個月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組 織（雞、鴨肉/肝臟、魚、蝦、等）、蜂蜜 1）取 3g樣本，加 3ml 0.1M 碳酸鹽緩沖溶液振蕩至蜂蜜全部
2）加入 9ml 乙酸乙酯，振蕩 5 分鐘，室溫 4000 轉/分，離心5 分鐘；
3）取上層有機相 6ml 至另一離心管中，加入 2ml 乙酸乙酯，2ml 2M 氫氧化鈉溶液，振蕩 5 分鐘，室溫 4000 轉/分，離心 5 分鐘；
4）取 4ml 清澈上層有機相至干凈玻璃試管中，30～40℃氮氣或空氣吹干；
5）加入正己烷 1ml，渦動 30s，再加入 0.5ml 復溶液混合 30秒，室溫 4000 轉/分以上，離心 5 分鐘；
6）去除上層有機相，取下層 50μl 液體用于分析。稀釋倍數 0.5 檢測下限 0.25ppb
6 酶聯免疫試驗步驟
將所需試劑從 4℃冷藏環境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于 2-8℃。
6.1 編 號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做 2 孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應：加標準品或樣本 50μl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液 50μl/孔，輕輕振蕩 5 秒混勻，25℃避光反應30分鐘。
6.3 洗 滌：將孔內液體甩干，用工作洗滌液 250μl/孔充分洗滌 5 次，每次間隔 30 秒，最后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 加酶反應：加酶標記物 100μl/孔，25℃避光反應 30 分鐘。
6.5 洗滌：同上
6.6 顯 色：加底物液 A 50μl/孔，再加底物液 B 50μl/孔，輕輕振蕩 5 秒混勻，25℃避光顯色 15 分鐘（若藍色過淺，可適當延長反應時間）。
6.7 終止：每孔加入終止液 50μl，輕輕振蕩混勻，終止反應。
6.8 測吸光值：用酶標儀于 450nm 處測定每孔吸光度值（建議用雙波長 450/630nm）。測定應在終止反應后 10 分鐘內完成。
7 結果分析
7.1 百分吸光率的計算
標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸
光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準液（0ppb）的吸光度 值，再乘以 100%，即
| 百分吸光度值（%）＝ | A | ×100% |
| A0 |
A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb 標準溶液的平均吸光度值
7.2 標準曲線的繪制與計算
以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準液的半對數曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實際濃度。若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）
8 注意事項
8.1 室溫低于 25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的 OD 值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在 ELISA 分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0 標準的吸光度值小于 0.5 個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。
8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，避免冷凍。
保 質 期：該產品有效期為 1 年，生產日期見包裝盒。
