（酶聯(lián)免疫法）
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法檢測組織（牛肉、雞肉和豬肉）等樣本中的金剛烷胺藥物（Amantadine，Am），試劑盒由預包被偶聯(lián)抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣本溶液，樣本中的金剛烷胺藥物和酶標板上預包被偶聯(lián)抗原競爭抗金剛烷胺藥物抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光度值與其所含金剛烷胺藥物含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中金剛烷胺藥物的殘留量。
2 技術(shù)指標
2.1 試劑盒靈敏度：0.5 ppb(ng/ml)
2.2 反應模式：25℃，30min～30min～15min
2.3 檢測下限：
組織（牛肉、雞肉和豬肉）…………0.5ppb
2.4 交叉反應率：
剛烷胺…………………………………100%
阿莫西林………………………………＜0.1%
頭孢噻呋………………………………＜0.1%
2.5 樣本回收率：
組織…………………………………90%±20%
3 試劑盒組成
酶標板……………………………96 孔
標準液：各 1ml
0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
高標準液（紅蓋）：100ppb………1ml
酶標記物（紅蓋）…………………11ml
抗體工作液（藍蓋）………………5.5ml
底物液 A（白蓋）……………………6ml
底物液 B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X 濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
2X 復溶液(黃蓋)……………………50ml
說明書………………………………1 份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）
4.2 微量移液器：單道 20μl-200μl，100μl-1000μl、多道 300μl
4.3 試劑：乙腈、去離子水
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
5.2 配液：
配液 1：復溶液將2×復溶液用去離子水 2 倍稀釋（1 份復溶液加 1 份去離子水）,用于樣本的復溶，復溶液在 4℃環(huán)境可保存一個月。配液 2:工作洗滌液
將濃縮洗滌液 20 倍稀釋(1 份洗滌液加 19 份去離子水)。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織樣本處理方法：
1）稱取均質(zhì)后的組織樣本 3±0.05g，加入 6ml 乙腈、1g 無水硫酸鈉，充分振蕩 3min，室溫 4000r/min 以上離心 10min。
2）取上清液 2ml 在 50-60℃條件下氮氣或空氣流吹至完全干燥。
3）加入 0.5ml 復溶液、0.5ml 正己烷混合振蕩 30s 于 4000r/min 以上離心 5min，除去上層，取下層液體 100μl 進行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：0.5 檢測下限：0.5ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
將所需試劑從 4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡 30min 以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于 2-8℃。
6.1 編 號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做 2 孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。 6.2 加樣反應：加標準品或樣本 100μl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液 50μl/孔，輕輕振蕩 5 秒混勻，25℃避光反應30分鐘。
6.3 洗 滌：將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液 250μl/孔充分洗滌 5 次，每次間隔 30 秒，最后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 加酶反應：加酶標記物 100μl/孔，25℃避光反應 30 分鐘。
6.5 洗 滌：同上
6.6 顯 色：加底物液 A 50μl/孔，再加底物液 B 50μl/孔，輕輕振蕩 5 秒混勻，25℃避光顯色 15 分鐘（若藍色過淺，可適當延長反應時間）。
6.7 終 止：每孔加入終止液 50μl，輕輕振蕩混勻，終止反應。
6.8 測吸光值：用酶標儀于 450nm 處測定每孔吸光度值（建議用雙波長 450/630nm）。測定應在終止反應后 10 分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以 100%，即
| 百分吸光度值（%）＝ | A | ×100% |
| A0 |
A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb 標準溶液的平均吸光度值
7.2 標準曲線的繪制與計算
以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）
8 注意事項
8.1 室溫低于 25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的 OD 值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。0 標準的吸光度值小于 0.5 個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
