Bovine COMT ELISA Kit用途：
該試劑盒適用于檢測體外血清、血漿或其他相關(guān)生物液體，對檢測的樣品進(jìn)行定性/相對定量的統(tǒng)計分析。
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基本性能：
性 能：
靈敏度：?12.5pg/ml
特異性：?不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)
重復(fù)性：?板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15%
檢測范圍：62.5→4000pg/ml
檢測原理：
本試劑盒采用雙抗體夾心SP-ELISA方法:將特異性的捕獲抗體包被于高親和力的酶標(biāo)板上，酶標(biāo)板中對應(yīng)加入標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品，樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的靶蛋白被捕獲，生物素化的檢測抗體與靶蛋白結(jié)合， SP復(fù)合物與生物素化檢測抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，檢測過程中每一步經(jīng)過洗滌液的徹底洗滌，游離的成分均被洗去，用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的作用下，若反應(yīng)孔中有靶蛋白則顯藍(lán)色，加入終止液后變黃色，用酶標(biāo)儀在450 nm處測OD值，靶蛋白濃度與OD值之間呈正比，根據(jù)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中靶蛋白的含量，進(jìn)而對檢測的樣品進(jìn)行定性/相對定量的統(tǒng)計分析。
試驗所需自備物品：
1：酶標(biāo)儀(450nm波長濾光片)
2：高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3：37℃恒溫箱
4：雙蒸水或去離子水
樣品收集方法：
1：血清：全血樣品于室溫放置1小時或2-8℃過夜后于2-8℃，1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。
2：血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于2-8℃，1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測。
3：組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比，比如1 g的組織樣品對應(yīng)9 mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行反復(fù)凍融或超聲破碎。最后將勻漿液于2-8℃，5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測。
4：細(xì)胞提取液：貼壁 細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞；懸浮細(xì)胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用冷的PBS洗滌3次。每106個細(xì)胞中加入150-200 μL PBS重懸(推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可減少PBS的體積)并通過反復(fù)凍融或超聲使細(xì)胞破碎。
將提取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測。
5：細(xì)胞培養(yǎng)上清或其他生物體液：收集液體后于2-8℃，1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測。
樣品注意事項：
1：收集血液的試管應(yīng)為一次性無內(nèi)毒素試管。避免使用溶血，高血脂樣品。
2：樣品收集后在1周內(nèi)進(jìn)行檢測可保存于2-8℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個月內(nèi)檢測)，或-80℃(3個月內(nèi)檢測)，避免反復(fù)凍融。在檢測前，冷凍過的樣本應(yīng)緩慢地融化并離心除去凍融過程產(chǎn)生的沉淀物。室溫混勻后使用。
3：試劑盒檢測范圍不等同于樣本中待測物的濃度范圍，建議實驗前通過相關(guān)文獻(xiàn)預(yù)估樣本中待測物的濃度并通過預(yù)實驗確定樣本的實際濃度情況。如果樣品中待測物濃度過高或者過低，請對樣本做適當(dāng)?shù)南♂尰蛘邼饪s。
4：若所檢樣本不在說明書所列樣本之中，建議做預(yù)實驗驗證其檢測有效性。
5：若使用化學(xué)裂解液制備組織勻漿或細(xì)胞提取液，由于引入某些化學(xué)物質(zhì)會導(dǎo)致ELISA測值出現(xiàn)偏差。
6：某些重組蛋白可能與試劑盒中捕獲或檢測抗體不匹配而出現(xiàn)不能檢測的情況。
樣本稀釋方案：
請?zhí)崆邦A(yù)估樣本的濃度范圍，如果您的檢測樣本需要稀釋，參考稀釋方案如下：
稀釋100倍：一步稀釋。取5μL樣本到495μL通用稀釋液內(nèi)，做100倍稀釋；
稀釋1000倍： 兩步稀釋。取5μL樣本到95μL通用稀釋液內(nèi)，做20倍稀釋，再取5μL 20倍稀釋樣本到245μL通用稀釋液內(nèi)，做50倍稀釋，總共稀釋1000倍；
稀釋100000倍：
三步稀釋。取5μL樣本到195μL通用稀釋液內(nèi)，做40倍稀釋，再取5μL 40倍稀釋樣本到245μL通用稀釋液內(nèi)，做50倍稀釋，最后取5μL 2000倍稀釋樣本到245μL通用稀釋液內(nèi)，做50倍稀釋，總共稀釋100000倍；每步稀釋時取液量不少于3 μL，稀釋倍數(shù)不超過100倍。每步稀釋都需混合均勻，避免起泡。
Bovine COMT ELISA Kit檢測前準(zhǔn)備工作:
1：提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫(18-25℃)。如果試劑盒需分多次使用，請僅取出本次實驗所需的酶標(biāo)板條和試劑，剩余板條和試劑需按照指定條件保存。
2：洗滌液配置：用蒸餾水1:20稀釋（例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的蒸餾水）。
3：標(biāo)準(zhǔn)品配制：取7支 EP 管，分別標(biāo)注S1,S2,S3,S4,S5,S6，blank,每管中加入 500μL 1×標(biāo)準(zhǔn)品及樣品稀釋液,從試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品管中吸取 500μL 移至第一管S1中，混勻后吸取500ul移至第二管S2中，如此反復(fù)作對倍稀釋，從第六管S6中吸出500ul棄去，第七管為空白對照。標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為: 4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0 pg/ml。
4：生物素化抗體工作液配置:使用前20分鐘，用生物素化抗體稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×工作液，根據(jù)所需用量配置，當(dāng)日使用，剩余棄之。
5：SP復(fù)合物工作液配置:使用前20分鐘，用SP復(fù)合物稀釋液將100×SP復(fù)合物稀釋成1×工作液，根據(jù)所需用量配置，當(dāng)日使用，剩余棄之。
6：如果您檢測的樣本中靶蛋白濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，建議重新檢測，請根據(jù)實際情況，適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議做預(yù)實驗，以確定稀釋倍數(shù))。
操作步驟：
1：加樣：空白孔加入50μl 1×標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液，其余孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品50ul，將反應(yīng)板混勻后置37℃，50分鐘。
2：洗板：用1×洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌3次，每孔加入1×洗液350μl，每次震蕩/浸泡1-2分鐘，向濾紙上印干。
3：空白孔加入100ul生物素化抗體稀釋液，其余孔各加入1×的生物素化抗體工作液100ul，混勻后置37℃，40分鐘。
4：洗板：同上。
5：每孔加入SABC復(fù)合物工作液100ul，混勻后置37℃，30分鐘。
6：洗板：用1×洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌5次，每孔加入1×洗液350μl，每次震蕩/浸泡1-2分鐘，向濾紙上印干。
7：每孔加入TMB顯色液90ul，混勻后置37 ℃暗處反應(yīng)10-25分鐘（具體顯色時間根據(jù)顯色結(jié)果而定）。
8：每孔加入100ul終止液，混勻，30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值。每孔加入100ul終止液，混勻，30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值。
Bovine COMT ELISA Kit聲明：
1：限于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平，尚不能對所有原料進(jìn)行全面的鑒定分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。
2：最終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當(dāng)時的實驗環(huán)境等因素密切相關(guān)，本公司只對試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對因使用試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請使用者使用前充分考慮到樣本可能的使用量，預(yù)留充足的樣本。
3：為了達(dá)到好的實驗結(jié)果，請只使用本公司試劑盒內(nèi)提供的試劑，不要混用其他制造商的產(chǎn)品，嚴(yán)格按照說明書操作。
4：由于操作過程中試劑制備以及酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)置不正確，可能導(dǎo)致結(jié)果異常，實驗前請仔細(xì)閱讀說明書并調(diào)整好儀器。
5：即使是相同人員操作也可能在兩次獨立實驗中得到不同的結(jié)果，為保證結(jié)果的重現(xiàn)性，需要控制實驗過程中每一步的操作。
6：試劑盒發(fā)貨前會經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)檢，然而，因為運輸條件、實驗設(shè)備差異等等因素影響，用戶檢測結(jié)果可能跟出廠數(shù)據(jù)不一致。不同批次間試劑盒間的差異也可能來自上述原因。
7：本試劑盒未與其他廠家同類試劑盒或不同方法檢測同一目的物的產(chǎn)品進(jìn)行對比，所以不排除檢測結(jié)果不一致的情況。
8：試劑盒僅供研究使用，如將其用于臨床診斷或任何其他用途，我公司將不對因此產(chǎn)生的問題負(fù)責(zé)，亦不承擔(dān)任何法律責(zé)任。
