Chicken DKK-1 ELISA Kit用途：
該試劑盒適用于檢測(cè)體外血清、血漿或其他相關(guān)生物液體，對(duì)檢測(cè)的樣品進(jìn)行定性/相對(duì)定量的統(tǒng)計(jì)分析。
?
基本性能：
性 能：
靈敏度：?12.5pg/ml
特異性：?不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類(lèi)似物交叉反應(yīng)
重復(fù)性：?板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15%
檢測(cè)范圍：62.5→4000pg/ml
檢測(cè)原理：
本試劑盒采用雙抗體夾心SP-ELISA方法:將特異性的捕獲抗體包被于高親和力的酶標(biāo)板上，酶標(biāo)板中對(duì)應(yīng)加入標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品，樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的靶蛋白被捕獲，生物素化的檢測(cè)抗體與靶蛋白結(jié)合， SP復(fù)合物與生物素化檢測(cè)抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，檢測(cè)過(guò)程中每一步經(jīng)過(guò)洗滌液的徹底洗滌，游離的成分均被洗去，用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的作用下，若反應(yīng)孔中有靶蛋白則顯藍(lán)色，加入終止液后變黃色，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)OD值，靶蛋白濃度與OD值之間呈正比，根據(jù)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品中靶蛋白的含量，進(jìn)而對(duì)檢測(cè)的樣品進(jìn)行定性/相對(duì)定量的統(tǒng)計(jì)分析。
試驗(yàn)所需自備物品：
1：酶標(biāo)儀(450nm波長(zhǎng)濾光片)
2：高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3：37℃恒溫箱
4：雙蒸水或去離子水
樣品收集方法：
1：血清：全血樣品于室溫放置1小時(shí)或2-8℃過(guò)夜后于2-8℃，1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)。
2：血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于2-8℃，1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)。
3：組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱(chēng)重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比，比如1 g的組織樣品對(duì)應(yīng)9 mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行反復(fù)凍融或超聲破碎。最后將勻漿液于2-8℃，5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測(cè)。
4：細(xì)胞提取液：貼壁 細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞；懸浮細(xì)胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用冷的PBS洗滌3次。每106個(gè)細(xì)胞中加入150-200 μL PBS重懸(推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可減少PBS的體積)并通過(guò)反復(fù)凍融或超聲使細(xì)胞破碎。
將提取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測(cè)。
5：細(xì)胞培養(yǎng)上清或其他生物體液：收集液體后于2-8℃，1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測(cè)。
樣品注意事項(xiàng)：
1：收集血液的試管應(yīng)為一次性無(wú)內(nèi)毒素試管。避免使用溶血，高血脂樣品。
2：樣品收集后在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)可保存于2-8℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個(gè)月內(nèi)檢測(cè))，或-80℃(3個(gè)月內(nèi)檢測(cè))，避免反復(fù)凍融。在檢測(cè)前，冷凍過(guò)的樣本應(yīng)緩慢地融化并離心除去凍融過(guò)程產(chǎn)生的沉淀物。室溫混勻后使用。
3：試劑盒檢測(cè)范圍不等同于樣本中待測(cè)物的濃度范圍，建議實(shí)驗(yàn)前通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)預(yù)估樣本中待測(cè)物的濃度并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定樣本的實(shí)際濃度情況。如果樣品中待測(cè)物濃度過(guò)高或者過(guò)低，請(qǐng)對(duì)樣本做適當(dāng)?shù)南♂尰蛘邼饪s。
4：若所檢樣本不在說(shuō)明書(shū)所列樣本之中，建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其檢測(cè)有效性。
5：若使用化學(xué)裂解液制備組織勻漿或細(xì)胞提取液，由于引入某些化學(xué)物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致ELISA測(cè)值出現(xiàn)偏差。
6：某些重組蛋白可能與試劑盒中捕獲或檢測(cè)抗體不匹配而出現(xiàn)不能檢測(cè)的情況。
Chicken DKK-1 ELISA Kit樣本稀釋方案：
請(qǐng)?zhí)崆邦A(yù)估樣本的濃度范圍，如果您的檢測(cè)樣本需要稀釋?zhuān)瑓⒖枷♂尫桨溉缦拢?/span>
稀釋100倍：一步稀釋。取5μL樣本到495μL通用稀釋液內(nèi)，做100倍稀釋?zhuān)?/span>
稀釋1000倍： 兩步稀釋。取5μL樣本到95μL通用稀釋液內(nèi)，做20倍稀釋?zhuān)偃?μL 20倍稀釋樣本到245μL通用稀釋液內(nèi)，做50倍稀釋?zhuān)偣蚕♂?000倍；
稀釋100000倍：
三步稀釋。取5μL樣本到195μL通用稀釋液內(nèi)，做40倍稀釋?zhuān)偃?μL 40倍稀釋樣本到245μL通用稀釋液內(nèi)，做50倍稀釋?zhuān)詈笕?μL 2000倍稀釋樣本到245μL通用稀釋液內(nèi)，做50倍稀釋?zhuān)偣蚕♂?00000倍；每步稀釋時(shí)取液量不少于3 μL，稀釋倍數(shù)不超過(guò)100倍。每步稀釋都需混合均勻，避免起泡。
檢測(cè)前準(zhǔn)備工作:
1：提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫(18-25℃)。如果試劑盒需分多次使用，請(qǐng)僅取出本次實(shí)驗(yàn)所需的酶標(biāo)板條和試劑，剩余板條和試劑需按照指定條件保存。
2：洗滌液配置：用蒸餾水1:20稀釋?zhuān)ɡ?ml濃縮洗滌液加入19ml的蒸餾水）。
3：標(biāo)準(zhǔn)品配制：取7支 EP 管，分別標(biāo)注S1,S2,S3,S4,S5,S6，blank,每管中加入 500μL 1×標(biāo)準(zhǔn)品及樣品稀釋液,從試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品管中吸取 500μL 移至第一管S1中，混勻后吸取500ul移至第二管S2中，如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋?zhuān)瑥牡诹躍6中吸出500ul棄去，第七管為空白對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)濃度為: 4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0 pg/ml。
4：生物素化抗體工作液配置:使用前20分鐘，用生物素化抗體稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×工作液，根據(jù)所需用量配置，當(dāng)日使用，剩余棄之。
5：SP復(fù)合物工作液配置:使用前20分鐘，用SP復(fù)合物稀釋液將100×SP復(fù)合物稀釋成1×工作液，根據(jù)所需用量配置，當(dāng)日使用，剩余棄之。
6：如果您檢測(cè)的樣本中靶蛋白濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，建議重新檢測(cè)，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況，適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù))。
Chicken DKK-1 ELISA Kit操作步驟：
1：加樣：空白孔加入50μl 1×標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液，其余孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品50ul，將反應(yīng)板混勻后置37℃，50分鐘。
2：洗板：用1×洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌3次，每孔加入1×洗液350μl，每次震蕩/浸泡1-2分鐘，向?yàn)V紙上印干。
3：空白孔加入100ul生物素化抗體稀釋液，其余孔各加入1×的生物素化抗體工作液100ul，混勻后置37℃，40分鐘。
4：洗板：同上。
5：每孔加入SABC復(fù)合物工作液100ul，混勻后置37℃，30分鐘。
6：洗板：用1×洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌5次，每孔加入1×洗液350μl，每次震蕩/浸泡1-2分鐘，向?yàn)V紙上印干。
7：每孔加入TMB顯色液90ul，混勻后置37 ℃暗處反應(yīng)10-25分鐘（具體顯色時(shí)間根據(jù)顯色結(jié)果而定）。
8：每孔加入100ul終止液，混勻，30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。每孔加入100ul終止液，混勻，30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。
聲明：
1：限于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平，尚不能對(duì)所有原料進(jìn)行全面的鑒定分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。
2：最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境等因素密切相關(guān)，本公司只對(duì)試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對(duì)因使用試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請(qǐng)使用者使用前充分考慮到樣本可能的使用量，預(yù)留充足的樣本。
3：為了達(dá)到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請(qǐng)只使用本公司試劑盒內(nèi)提供的試劑，不要混用其他制造商的產(chǎn)品，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。
4：由于操作過(guò)程中試劑制備以及酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)置不正確，可能導(dǎo)致結(jié)果異常，實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)并調(diào)整好儀器。
5：即使是相同人員操作也可能在兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中得到不同的結(jié)果，為保證結(jié)果的重現(xiàn)性，需要控制實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每一步的操作。
6：試劑盒發(fā)貨前會(huì)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)檢，然而，因?yàn)檫\(yùn)輸條件、實(shí)驗(yàn)設(shè)備差異等等因素影響，用戶(hù)檢測(cè)結(jié)果可能跟出廠(chǎng)數(shù)據(jù)不一致。不同批次間試劑盒間的差異也可能來(lái)自上述原因。
7：本試劑盒未與其他廠(chǎng)家同類(lèi)試劑盒或不同方法檢測(cè)同一目的物的產(chǎn)品進(jìn)行對(duì)比，所以不排除檢測(cè)結(jié)果不一致的情況。
8：試劑盒僅供研究使用，如將其用于臨床診斷或任何其他用途，我公司將不對(duì)因此產(chǎn)生的問(wèn)題負(fù)責(zé)，亦不承擔(dān)任何法律責(zé)任。
