簡介
氯丙那林屬于β2型受體激動(dòng)劑，有明顯的支氣管擴(kuò)張作用，臨床用于治療支氣管炎、喘息性支氣管炎等。不法養(yǎng)殖戶將氯丙那林添加到動(dòng)物飲用水或飼料中， 用來增加動(dòng)物的瘦肉率，因此，對于氯丙那林這種新型“瘦肉精” ，農(nóng)業(yè)部明確該藥物禁用于養(yǎng)殖動(dòng)物。目前，常用檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜法、氣相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用法等。由于以上方法均需先進(jìn)檢測儀器、檢測費(fèi)用昂貴、步驟繁瑣、耗時(shí)，且對操作人員專業(yè)性要求較高，不適用于基層企事業(yè)單位的大通量快速篩查檢測。本酶聯(lián)免疫法，測定動(dòng)物組織中氯丙那林藥物的殘留量，具有檢測限低、特異性強(qiáng)、操作簡便、檢測速度快、檢測成本低，非常容易推廣等優(yōu)點(diǎn)。
檢測原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中氯丙那林和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭氯丙那林抗體，加入酶標(biāo)二抗后，形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。隨后結(jié)合的酶催化TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的氯丙那林成負(fù)相關(guān)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確定量樣品中氯丙那林的含量。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得值乘以樣品處理的稀釋倍數(shù)即為實(shí)際樣品中氯丙那林的含量。
間接競爭法模式圖
按操作順序形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物后，加入TMB 底物，板孔液體由無色變成藍(lán)色，再加入終止液液體變?yōu)辄S色后進(jìn)行吸光度值測定。
檢測實(shí)驗(yàn)的局限性
僅供科研使用。
試劑盒的使用期限不得超過試劑盒標(biāo)簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來源的試劑混合使用或替換使用。
如果樣品產(chǎn)生的值高于最高標(biāo)準(zhǔn)，則用測定稀釋劑進(jìn)一步稀釋樣品，并重復(fù)測定。稀釋劑、操作人員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、培養(yǎng)時(shí)間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導(dǎo)致結(jié)合變化。
樣本采集、處理和存儲(chǔ)的變化可能會(huì)導(dǎo)致樣本值的差異。
本試劑盒實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)消除了不同樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。
操作要點(diǎn)
為了避免交叉污染，在添加每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑時(shí)應(yīng)更換移液器槍頭。
當(dāng)使用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測定精度。
顯色劑應(yīng)保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。
應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍(lán)色變?yōu)辄S色。藍(lán)色的孔表示終止液未與溶液充分混合。
需要的其他材料
? 酶標(biāo)儀，包含450nm測定波長，同時(shí)包含600-680nm校正波長更佳；
? 移液器及槍頭；
? 蒸餾水或去離子水
? 100-1000mL刻度量筒。
? 洗瓶、排槍或自動(dòng)微孔板清洗機(jī)。
? 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度。
? 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。
樣品預(yù)處理
下面列出的樣品收集和儲(chǔ)存條件旨在作為一般性指導(dǎo)。樣品穩(wěn)定性尚未評估。
1. 尿樣：取尿樣本上清50μL進(jìn)行檢測。（如混濁需離心或過濾）
樣品稀釋倍數(shù)：0.5倍
2. 飼料樣本
（1）稱取1g±0.05g飼料樣本，加入10ml 0.01mol/L HCL，震蕩10min，4000r/min離心10min；
（2）取上清100μL加入400μL 0.2mol/L PB，混勻后取50μL進(jìn)行檢測。
樣品稀釋倍數(shù)：50倍
3. 組織樣品
（1）稱取1g組織樣本；加入2mL的1×PBS，震蕩2min，4000r/min離心10min；
（2）取上清50μL進(jìn)行檢測。
樣品稀釋倍數(shù)：3倍
4. 其它生物標(biāo)本：3000r/min 離心10min，取上清即可檢測。
試劑準(zhǔn)備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配制：如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標(biāo)準(zhǔn)品配制：試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個(gè)試管，先將1000 ppb標(biāo)準(zhǔn)品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至 320ppb（例：320μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+680μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的320ppb濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個(gè)試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個(gè)單獨(dú)的試管中將320 ppb標(biāo)準(zhǔn)品依次 2 倍倍比稀釋至7個(gè)梯度，共配制7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為：320 ppb、160 ppb、80 ppb、40 ppb、20 ppb、10 ppb、5 ppb，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個(gè)試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0ppb)。
一抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據(jù)所需用量配置。
酶標(biāo)二抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標(biāo)二抗稀釋成1×酶標(biāo)抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。
備注：如樣本中待測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實(shí)驗(yàn)之前做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)二抗溶液根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需酶標(biāo)板孔數(shù)吸取一定量配制工作液，剩余溶液應(yīng)放回-20℃儲(chǔ)存，且避免反復(fù)凍融。（若實(shí)驗(yàn)在1-2周內(nèi)做完，標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于2-8℃保存；若實(shí)驗(yàn)為長時(shí)間跨度實(shí)驗(yàn)，建議將標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于-20℃保存，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性）
實(shí)驗(yàn)步驟
所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品建議復(fù)孔檢測
1. 樣本孵育：每孔分別加入50μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品/預(yù)處理過的待測樣品，同時(shí)加入抗試劑50μL/孔（加抗試劑時(shí)請使用多道移液器），蓋上封板膜在37℃下孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，輕輕晃動(dòng)30秒，甩干并在紙上拍干，以這種方式清洗3次。
2. 二抗孵育：每孔加入100μL酶標(biāo)抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，重復(fù)步驟1中的清洗方式清洗4次。
3. 底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育15分鐘。（加顯色液時(shí)請使用多道移液器，根據(jù)樣品和對照抗體的顏色，自行控制顯色時(shí)間）
4. 終止反應(yīng)：待顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μL終止液（加終止液時(shí)請使用多道移液器），輕輕混勻，5分鐘內(nèi)用預(yù)熱完成的酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值。
實(shí)驗(yàn)步驟匯總
1. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品和一抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌3次。
2. 加酶標(biāo)二抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌4次。
3. 加顯色液，37℃避光反應(yīng)15分鐘。
4. 加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。
結(jié)果的計(jì)算
以濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件來創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評估。
批內(nèi)變異系數(shù) CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。
批間變異系數(shù) CV%小于15%。
回收率
樣本回收率：80%-120%
靈敏度
經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為 5 ppb。
線性關(guān)系
校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.999。
交叉反應(yīng)性
氯丙那林：100%
注意事項(xiàng)
1. 此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹(jǐn)慎操作。
2. 該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會(huì)引起皮膚過敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
3. 顯色劑B可能會(huì)引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
4. 佩戴防護(hù)手套、防護(hù)服、眼睛和面部防護(hù)用品。處理后徹底洗手。
本試劑盒由上海酶聯(lián)生物提供，有關(guān)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線和數(shù)據(jù)請下載本產(chǎn)品說明書
