簡介
甲基汞（CH3Hg）是汞的甲基化產(chǎn)物，是一種具有神經(jīng)毒性的環(huán)境污染物，在自然界中，無論是在厭氧還是需氧的條件下，含汞的化合物都能被微生物轉(zhuǎn)化成甲基汞或二甲基汞。主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可嚴重造成語言和記憶能力障礙等，劇毒；其損害的主要部位是大腦的枕葉和小腦，其神經(jīng)毒性可能與擾亂谷氨酸的重攝取和致使神經(jīng)細胞基因表達異常。2017年10月27日，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)公布的致癌物清單初步整理參考，甲基汞化合物在2B類致癌物清單中。
酶聯(lián)免疫分析法是檢測重金屬離子的一種新方法，與傳統(tǒng)檢測方法相比，該方法省時、便攜、易操作，適用于重金屬離子的現(xiàn)場快速檢測，具有操作簡單、檢測時間短的特點，適用于各類企業(yè)、檢測機構(gòu)、監(jiān)督部門對重金屬甲基汞超標的現(xiàn)場快速檢測。
檢測原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中甲基汞和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭甲基汞抗體，加入酶標二抗后，形成包被抗原-抗體-酶標二抗復合物。隨后結(jié)合的酶催化TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的甲基汞成負相關。通過標準曲線可準確定量樣品中甲基汞的含量。通過標準曲線計算所得值乘以樣品處理的稀釋倍數(shù)即為實際樣品中甲基汞的含量。
間接競爭法模式圖
按操作順序形成包被抗原-抗體-酶標二抗復合物后，加入TMB 底物，板孔液體由無色變成藍色，再加入終止液液體變?yōu)辄S色后進行吸光度值測定。
檢測實驗的局限性
僅供科研使用。
試劑盒的使用期限不得超過試劑盒標簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來源的試劑混合使用或替換使用。
如果樣品產(chǎn)生的值高于最高標準，則用測定稀釋劑進一步稀釋樣品，并重復測定。稀釋劑、操作人員、移液技術、洗滌技術、培養(yǎng)時間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導致結(jié)合變化。
樣本采集、處理和存儲的變化可能會導致樣本值的差異。
本試劑盒實驗設計消除了不同樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。
操作要點
為了避免交叉污染，在添加每個標準品、樣品和試劑時應更換移液器槍頭。
當使用自動洗板機時，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測定精度。
顯色劑應保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。
應按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍色變?yōu)辄S色。藍色的孔表示終止液未與溶液充分混合。
需要的其他材料
? 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
? 移液器及槍頭；
? 蒸餾水或去離子水
? 100-1000mL刻度量筒。
? 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機。
? 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度。
? 用于稀釋標準品和樣品的試管。
樣品預處理
下面列出的樣品收集和儲存條件旨在作為一般性指導。樣品穩(wěn)定性尚未評估。
1. 水樣：取水樣本上清50μL進行檢測。（如混濁需離心或過濾）
樣品稀釋倍數(shù)：1倍
2. 玉米、小麥、大米等糧食飼料處理方法：
粉碎并取5g的樣品置于50mL離心管中，加入25mL的40%乙醇水與其混勻。于振蕩器上劇烈震蕩10min，轉(zhuǎn)速為150r/min（或渦旋震蕩5min以上），震蕩后于4000r/min離心5min（或靜置3min）。
取上清溶液200μL，再加入600μL的1×PBS進行稀釋，混勻后取50μL進行檢測
樣品稀釋倍數(shù)：20
3. 其它生物標本：3000r/min 離心10min，取上清即可檢測。
試劑準備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配制：如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標準品配制：試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先將3000 ppb標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至1600 ppb（例：533μL的標準品母液+467 μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的1600 ppb濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將1600 ppb標準品依次 2 倍倍比稀釋至7個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為：1600 ppb、800 ppb、400 ppb、200 ppb、100 ppb、50 ppb、25 ppb，從最高濃度標準品溶液中吸取200μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0ppb/mL)。
一抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據(jù)所需用量配置。
酶標二抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標二抗稀釋成1×酶標抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。
備注：如樣本中待測物濃度高于標準品最高值，請根據(jù)實際情況選擇適當?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實驗之前做預實驗，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標準品母液及100×酶標二抗溶液根據(jù)實驗所需酶標板孔數(shù)吸取一定量配制工作液，剩余溶液應放回-20℃儲存，且避免反復凍融。（若實驗在1-2周內(nèi)做完，標準品母液及100×酶標抗體置于2-8℃保存；若實驗為長時間跨度實驗，建議將標準品母液及100×酶標抗體置于-20℃保存，以保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性）
實驗步驟
所有標準品、樣品建議復孔檢測
1. 樣本孵育：每孔分別加入50μL不同濃度的標準品/預處理過的待測樣品，同時加入抗試劑50μL/孔（加抗試劑時請使用多道移液器），蓋上封板膜在37℃下孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，輕輕晃動30秒，甩干并在紙上拍干，以這種方式清洗3次。
2. 二抗孵育：每孔加入100μL酶標抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，重復步驟1中的清洗方式清洗4次。
3. 底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育15分鐘。（加顯色液時請使用多道移液器，根據(jù)樣品和對照抗體的顏色，自行控制顯色時間）
4. 終止反應：待顯色反應結(jié)束后，每孔加入50μL終止液（加終止液時請使用多道移液器），輕輕混勻，5分鐘內(nèi)用預熱完成的酶標儀在450nm處測吸光值。
實驗步驟匯總
1. 加標準品/樣品和一抗，37℃反應30分鐘，洗滌3次。
2. 加酶標二抗，37℃反應30分鐘，洗滌4次。
3. 加顯色液，37℃避光反應15分鐘。
4. 加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。
結(jié)果的計算
以濃度的對數(shù)為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線。或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標準曲線。
若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數(shù)。
精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內(nèi)精度評估。
批內(nèi)變異系數(shù) CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。
批間變異系數(shù) CV%小于15%。
回收率
樣本回收率：80%-120%
靈敏度
經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為25 ppb。
線性關系
校準品劑量反應曲線相關系數(shù)r值，大于等于0.996。
交叉反應性
甲基汞：100%
注意事項
1. 此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應謹慎操作。
2. 該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應，應佩帶口罩避免吸入薄霧。
3. 顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應佩帶口罩避免吸入薄霧。
4. 佩戴防護手套、防護服、眼睛和面部防護用品。處理后徹底洗手。
