簡(jiǎn)介
金剛烷胺（AMA）是用于治療流感疾病的抗病毒藥物，農(nóng)業(yè)部2005年第560號(hào)公告規(guī)定禁止AMA類藥物在養(yǎng)殖業(yè)的使用，然而2012年“速生雞”事件反映了養(yǎng)禽業(yè)仍存在AMA濫用的問(wèn)題。研究表明，動(dòng)物飼養(yǎng)中AMA的濫用問(wèn)題增強(qiáng)了流感病毒的耐藥性，而且對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性等毒副作用。
金剛烷胺，是最早用于抑制流感病毒的抗病毒藥，也是抗震顫麻痹藥。適用于原發(fā)性帕金森病、腦炎后的帕金森綜合征、藥物誘發(fā)的錐體外系反應(yīng)、一氧化碳中毒后帕金森綜合征及老年人合并有腦動(dòng)脈硬化的帕金森綜合征。也可用于預(yù)防或治療亞洲甲-Ⅱ型流感病毒所引起的呼吸道感染。金剛烷胺與滅活的甲型流感病毒疫苗合用時(shí)可促使機(jī)體產(chǎn)生預(yù)防性抗體。但金剛烷胺治療劑量與產(chǎn)生副作用的劑量很接近，對(duì)高齡者及有慢性心肺疾病或腎臟疾病者的劑量和給藥計(jì)劃很難確定，因此尚未在臨床上推廣應(yīng)用。在日本，金剛烷胺一直作為帕金森病的治療藥，直到1998年才被批準(zhǔn)用于流感病毒A型感染性疾病的治療。由于金剛烷胺對(duì)動(dòng)物禽流感等病毒性疾病有較好的預(yù)防效果，因此常在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中使用，特別在養(yǎng)雞業(yè)中使用泛濫。未被代謝的金剛烷胺在禽蛋中殘留，通過(guò)食物鏈傳遞在人體內(nèi)積蓄，具有致精神異常的副作用，并會(huì)造成機(jī)體的耐藥性，誘導(dǎo)其發(fā)生變異，嚴(yán)重危害了人民生命健康。
本酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒可以經(jīng)濟(jì)、快速地檢測(cè)飼料等樣品中的金剛烷胺的殘留量。
檢測(cè)原理
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中金剛烷胺和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)金剛烷胺抗體，加入酶標(biāo)二抗后，形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。隨后結(jié)合的酶催化TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的金剛烷胺成負(fù)相關(guān)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確定量樣品中金剛烷胺的含量。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得值乘以樣品處理的稀釋倍數(shù)即為實(shí)際樣品中金剛烷胺的含量。
間接競(jìng)爭(zhēng)法模式圖
按操作順序形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物后，加入TMB 底物，板孔液體由無(wú)色變成藍(lán)色，再加入終止液液體變?yōu)辄S色后進(jìn)行吸光度值測(cè)定。
檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的局限性
僅供科研使用。
試劑盒的使用期限不得超過(guò)試劑盒標(biāo)簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來(lái)源的試劑混合使用或替換使用。
如果樣品產(chǎn)生的值高于最高標(biāo)準(zhǔn)，則用測(cè)定稀釋劑進(jìn)一步稀釋樣品，并重復(fù)測(cè)定。稀釋劑、操作人員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、培養(yǎng)時(shí)間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導(dǎo)致結(jié)合變化。
樣本采集、處理和存儲(chǔ)的變化可能會(huì)導(dǎo)致樣本值的差異。
本試劑盒實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)消除了不同樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。
操作要點(diǎn)
為了避免交叉污染，在添加每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑時(shí)應(yīng)更換移液器槍頭。
當(dāng)使用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測(cè)定精度。
顯色劑應(yīng)保持無(wú)色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。
應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍(lán)色變?yōu)辄S色。藍(lán)色的孔表示終止液未與溶液充分混合。
需要的其他材料
? 酶標(biāo)儀，包含450nm測(cè)定波長(zhǎng)，同時(shí)包含600-680nm校正波長(zhǎng)更佳；
? 移液器及槍頭；
? 蒸餾水或去離子水
? 100-1000mL刻度量筒。
? 洗瓶、排槍或自動(dòng)微孔板清洗機(jī)。
? 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度。
? 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。
樣品預(yù)處理
下面列出的樣品收集和儲(chǔ)存條件旨在作為一般性指導(dǎo)。樣品穩(wěn)定性尚未評(píng)估。
1. 血清：將收集于血清分離管的全血樣本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后 3000r/min 離心10min，取上清即可檢測(cè)。
2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集樣本，將樣本 3000r/min 離心10min，取上清即可檢測(cè)。
3. 組織勻漿：用 PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的 PBS（一般按 1:9 的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng) 9mL的PBS）。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液 3000r/min 離心10min，取上清即可檢測(cè)。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清：3000r/min 離心10min，取上清即可檢測(cè)。
5. 其它生物標(biāo)本：3000r/min 離心10min，取上清即可檢測(cè)。
試劑準(zhǔn)備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配制：如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標(biāo)準(zhǔn)品配制：試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個(gè)試管，先將3000ppb標(biāo)準(zhǔn)品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至729 ppb（例：243μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+757μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的729 ppb濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個(gè)試管中分別加入600μL的1×稀釋液，在這6個(gè)單獨(dú)的試管中將729 ppb標(biāo)準(zhǔn)品依次3倍倍比稀釋至7個(gè)梯度，共配制7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為：729 ppb、243 ppb、81 ppb、27 ppb、9 ppb、3 ppb、1ppb，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取300μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個(gè)試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0ppb)。
一抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據(jù)所需用量配置。
酶標(biāo)二抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標(biāo)二抗稀釋成1×酶標(biāo)抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。
備注：如樣本中待測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測(cè)樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實(shí)驗(yàn)之前做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)二抗溶液根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需酶標(biāo)板孔數(shù)吸取一定量配制工作液，剩余溶液應(yīng)放回-20℃儲(chǔ)存，且避免反復(fù)凍融。（若實(shí)驗(yàn)在1-2周內(nèi)做完，標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于2-8℃保存；若實(shí)驗(yàn)為長(zhǎng)時(shí)間跨度實(shí)驗(yàn)，建議將標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于-20℃保存，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性）
實(shí)驗(yàn)步驟
所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品建議復(fù)孔檢測(cè)
1. 樣本孵育：每孔分別加入50μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品/預(yù)處理過(guò)的待測(cè)樣品，同時(shí)加入抗試劑50μL/孔（加抗試劑時(shí)請(qǐng)使用多道移液器），蓋上封板膜在37℃下孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，輕輕晃動(dòng)30秒，甩干并在紙上拍干，以這種方式清洗3次。
2. 二抗孵育：每孔加入100μL酶標(biāo)抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，重復(fù)步驟1中的清洗方式清洗4次。
3. 底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育15分鐘。（加顯色液時(shí)請(qǐng)使用多道移液器，根據(jù)樣品和對(duì)照抗體的顏色，自行控制顯色時(shí)間）
4. 終止反應(yīng)：待顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μL終止液（加終止液時(shí)請(qǐng)使用多道移液器），輕輕混勻，5分鐘內(nèi)用預(yù)熱完成的酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。
實(shí)驗(yàn)步驟匯總
1. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品和一抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌3次。
2. 加酶標(biāo)二抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌4次。
3. 加顯色液，37℃避光反應(yīng)15分鐘。
4. 加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。
結(jié)果的計(jì)算
以濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件來(lái)創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評(píng)估。
批內(nèi)變異系數(shù) CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評(píng)估。
批間變異系數(shù) CV%小于15%。
回收率
樣本回收率：80%-120%
靈敏度
經(jīng)樣本測(cè)試，本試劑盒的檢測(cè)靈敏度為1 ppb。
線性關(guān)系
校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.999。
交叉反應(yīng)性
金剛烷胺：100%
注意事項(xiàng)
1. 此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹(jǐn)慎操作。
2. 該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會(huì)引起皮膚過(guò)敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
3. 顯色劑B可能會(huì)引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
4. 佩戴防護(hù)手套、防護(hù)服、眼睛和面部防護(hù)用品。處理后徹底洗手。
本試劑盒由上海酶聯(lián)生物提供，有關(guān)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線和數(shù)據(jù)請(qǐng)下載本產(chǎn)品說(shuō)明書
