簡(jiǎn)介

呋喃西林屬于硝基呋喃類抗菌藥物，可用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染引起的腸道感染疾病，因其不易產(chǎn)生抗藥性，曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用于禽類、畜類和水產(chǎn)類動(dòng)物的養(yǎng)殖中。養(yǎng)殖過程中使用呋喃西林藥物和食品消毒與漂白過程中使用次氯酸鹽會(huì)造成氨基脲殘留，其代謝物（氨基脲）屬于致癌化學(xué)物的一種，氨基脲會(huì)在生物體內(nèi)與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合形成穩(wěn)定的結(jié)合態(tài)，并且會(huì)長(zhǎng)期存在。普通的蒸煮、焙烤、磨碎或微波加熱方式均無法有效降解其在食物中的殘留量，人體若長(zhǎng)期食用此類食物會(huì)造成嚴(yán)重?fù)p害。

本酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒可以經(jīng)濟(jì)、快速地檢測(cè)動(dòng)物組織（肌肉、肝臟）、蜂蜜等樣品中的呋喃西林代謝物的殘留量。

檢測(cè)原理

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中呋喃西林和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)呋喃西林抗體，加入酶標(biāo)二抗后，形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。隨后結(jié)合的酶催化TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的呋喃西林成負(fù)相關(guān)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確定量樣品中呋喃西林的含量。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得值乘以樣品處理的稀釋倍數(shù)即為實(shí)際樣品中呋喃西林的含量。

按操作順序形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物后，加入TMB 底物，板孔液體由無色變成藍(lán)色，再加入終止液液體變?yōu)辄S色后進(jìn)行吸光度值測(cè)定。

檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的局限性

僅供科研使用。

試劑盒的使用期限不得超過試劑盒標(biāo)簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來源的試劑混合使用或替換使用。

如果樣品產(chǎn)生的值高于最高標(biāo)準(zhǔn)，則用測(cè)定稀釋劑進(jìn)一步稀釋樣品，并重復(fù)測(cè)定。稀釋劑、操作人員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、培養(yǎng)時(shí)間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導(dǎo)致結(jié)合變化。

樣本采集、處理和存儲(chǔ)的變化可能會(huì)導(dǎo)致樣本值的差異。

本試劑盒實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)消除了不同樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。

操作要點(diǎn)

為了避免交叉污染，在添加每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑時(shí)應(yīng)更換移液器槍頭。

當(dāng)使用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測(cè)定精度。

顯色劑應(yīng)保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。

應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍(lán)色變?yōu)辄S色。藍(lán)色的孔表示終止液未與溶液充分混合。

需要的其他材料

儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、恒溫水浴鍋、移液槍

試劑：氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、乙酸乙酯、濃HCL、正己烷、二硝基苯甲醛

樣品預(yù)處理

樣本前處理需配液：

1. 1mol/L鹽酸溶液：量取8.6mL濃鹽酸，加蒸餾水定容至100mL。

2. 衍生化試劑：稱取0.15g二硝基苯甲醛，加甲醇100mL溶解，4℃避光保存。

3. 0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液：稱22.8g磷酸氫二鉀，加蒸餾水溶解，定容至1000mL。

4. 1mol/L氫氧化鈉溶液：稱取4.0 g氫氧化鈉，加蒸餾水定容至100mL。

下面列出的樣品收集和儲(chǔ)存條件旨在作為一般性指導(dǎo)。樣品穩(wěn)定性尚未評(píng)估。

1.魚蝦和肉樣樣本

（1）稱取均質(zhì)后的組織樣本1±0.05g于50mL離心管中，依次加入4ml的蒸餾水，0.5mL 1mol/L HCL溶液和100μL衍生化試劑，充分振蕩3min。

（2）置于60℃水浴鍋中孵育1h（注意避光）。

（3）取出后依次加入5mL 0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液，0.4ml 1mol/L 氫氧化鈉溶液和6mL乙酸乙酯，充分混勻1min，4000r/min離心10min（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足3mL，需混勻后提高轉(zhuǎn)速和延長(zhǎng)離心時(shí)間重復(fù)離心）。

（4）移取上層溶液3mL于5ml離心管中，置于60℃氮吹儀中進(jìn)行吹干。

（5）吹干后加入2mL正己烷，渦旋震蕩1min，再加入1mL PBST緩沖液，充分混勻后于4000r/min離心10min；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，則重復(fù)離心）

（6）取50μL下層用于分析。

樣品稀釋倍數(shù)：2倍

2.蜂蜜樣本

（1）稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g于50mL離心管中，依次加入4ml的蒸餾水，0.5mL 1mol/L HCL溶液和100μL衍生化試劑，充分振蕩3min。

（2）置于60℃水浴鍋中孵育1h（注意避光）。

（3）取出后依次加入5mL 0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液，0.4ml 1mol/L 氫氧化鈉溶液和6mL乙酸乙酯，充分混勻1min，4000r/min離心10min（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足3mL，需混勻后提高轉(zhuǎn)速和延長(zhǎng)離心時(shí)間重復(fù)離心）。

（4）移取上層溶液3mL于5ml離心管中，置于60℃氮吹儀中進(jìn)行吹干。

（5）吹干后加入2mL正己烷，渦旋震蕩1min，再加入1mL PBST緩沖液，充分混勻后于4000r/min離心10min；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，則重復(fù)離心）

（6）取50μL下層用于分析。

樣品稀釋倍數(shù)：1倍

此方法與呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物試劑盒可合一處理。

試劑準(zhǔn)備

使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。

洗滌液/稀釋液配制：如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）

標(biāo)準(zhǔn)品配制：試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個(gè)試管，先將1000ppb標(biāo)準(zhǔn)品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至1ppb（例：1μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+999μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的1ppb濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在5個(gè)試管中分別加入400μL的1×稀釋液，在這6個(gè)單獨(dú)的試管中將1ppb標(biāo)準(zhǔn)品依次3倍倍比稀釋至5個(gè)梯度，共配制5個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為：1ppb、0.3ppb、0.1ppb、0.03ppb、0.01ppb、0.003ppb，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取200μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個(gè)試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0ppb)。

一抗工作液配制：使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據(jù)所需用量配置。

酶標(biāo)二抗工作液配制：使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標(biāo)二抗稀釋成1×酶標(biāo)抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。

備注：如樣本中待測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測(cè)樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實(shí)驗(yàn)之前做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)二抗溶液根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需酶標(biāo)板孔數(shù)吸取一定量配制工作液，剩余溶液應(yīng)放回-20℃儲(chǔ)存，且避免反復(fù)凍融。

實(shí)驗(yàn)步驟

所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品建議復(fù)孔檢測(cè)

1. 樣本孵育：每孔分別加入50μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品/預(yù)處理過的待測(cè)樣品，同時(shí)加入一抗試劑50μL/孔（加一抗試劑時(shí)請(qǐng)使用多道移液器），蓋上封板膜在37℃下孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，輕輕晃動(dòng)30秒，甩干并在紙上拍干，以這種方式清洗3次。。

2. 二抗孵育：每孔加入100μL酶標(biāo)抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，重復(fù)步驟1中的清洗方式清洗4次。

3. 底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育15分鐘。（加顯色液時(shí)請(qǐng)使用多道移液器，根據(jù)樣品和對(duì)照抗體的顏色，自行控制顯色時(shí)間）

4. 終止反應(yīng)：待顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μL終止液（加終止液時(shí)請(qǐng)使用多道移液器），輕輕混勻，5分鐘內(nèi)用預(yù)熱完成的酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。

實(shí)驗(yàn)步驟匯總

1. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品和一抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌3次。

2. 加酶標(biāo)二抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌4次。

3. 加顯色液，37℃避光反應(yīng)15分鐘。

4. 加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。

結(jié)果的計(jì)算

以濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮?shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件來創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

精密度

批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評(píng)估。

批內(nèi)變異系數(shù) CV%小于10%。

批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評(píng)估。

批間變異系數(shù) CV%小于15%。

回收率

樣本回收率：80%-120%

靈敏度

經(jīng)樣本測(cè)試，本試劑盒的檢測(cè)靈敏度為0.003ppb。

線性關(guān)系

校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù) r 值，大于等于 0.999。

交叉反應(yīng)性

呋喃西林：100%